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细胞复苏操作步骤


细胞复苏操作要点:


1、将培养基在37℃水浴锅预热;准备一个15mL无菌的离心管,加入8mL预热培养基。

2、将冻存细胞从液氮罐中取出,快速放入37℃水浴锅中复温(可准备一洁净的烧杯,装满37℃的水,细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内,再逐步转移到水浴锅中)。轻轻晃动冻存管,使细胞能在1~2min内完全解冻,使细胞能尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。注意冻存管管口不能没入水中,避免引起污染。

3、用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内,将管内细胞转移至准备好的离心管内,轻轻吹打液体,使细胞均匀分散,降低DMSO浓度,吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次,均转移至离心管内。

4、800rpm离心5min,弃上清,加入新鲜的培养基,吹打制成细胞悬液。

5、将细胞悬液转移至T25细胞瓶内,补加适量的培养基,轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀,放入温箱内培养。

6、第二天观察细胞贴壁生长情况,换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养,待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代,细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心,减少操作步骤,也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内,补加新鲜培养基,放入温箱内培养。但培养12~20h后必须换新鲜的培养基,移除死细胞。



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